Dans le secteur de Besançon, la Préhistoire la plus ancienne est représentée aux alentours de Beure, un village situé à 5 km au sud-ouest de la ville : perchée à 390 m, la grotte de Casamène (fouillée en 1969) a livré une occupation datée du Paléolithique moyen (50 000 ans avant notre ère) ; les Néandertaliens, qui l’utilisaient sans doute de façon temporaire comme halte de chasse, y ont laissé quelques outils moustériens (éclats de type Levallois). À Beure, sur la rive gauche de la rivière, des vestiges de foyers d’un campement de courte durée de chasseurs-cueilleurs, daté par le mobilier lithique du Mésolithique moyen (VIII^e millénaire) ont été fouillés récemment. Le silex à partir duquel ont été taillés les microlithes découverts sur ce site provient des bassins tertiaires de Haute-Saône, situés à une trentaine de kilomètres de Besançon.

Durant le Néolithique, des populations sédentarisées occupent à la fois des sites de hauteur et la plaine alluviale. Au sud-ouest de Besançon, l’abri sous roche du Rosemont protégeait deux sépultures et, sur le promontoire de la Roche d’Or, un habitat de la phase ancienne du Néolithique Moyen Bourguignon (vers 4000 avant notre ère) occupait deux terrasses barrées par des levées. Cette culture (NMB), couvrant la Franche-Comté et la moitié orientale de la Bourgogne entre 4300 et 3600 avant notre ère, est caractérisée par la forme des céramiques, la production en grande série de lames de haches polies en pélite vosgienne et l’émergence d’un réseau d’habitats fortifiés. Au cœur de la boucle du Doubs, les vestiges les plus anciens sont attribués à cette phase du Néolithique ; dans le quartier Saint-Paul (près du site du Collège Lumière), sous l’actuel Palais de Justice et à l’Îlot Pâris, ils correspondent à des concentrations de mobilier remanié par l’action de la rivière et révèlent sans doute des habitats ouverts.