À partir du V^e millénaire, et jusqu’au milieu du IV^e millénaire avant notre ère, va se développer la culture chasséenne, une des plus importantes du Néolithique moyen. Elle s’est formée dans le midi de la France pour s’étendre jusqu’au nord du territoire national. La région toulousaine est particulièrement bien documentée sur cette période puisque de grands établissements ont alors dominé la plaine alluviale de la Garonne : Saint-Michel-du-Touch à Toulouse, le Château Percin à Seilh, ou encore le site de Villeneuve-Tolosane et Cugnaux qui demeure aujourd’hui, avec une surface estimée à une trentaine d’hectares, l’une des plus vastes implantations chasséennes connues en France. Ces grands habitats, dont la durée d’occupation s’étale sur plusieurs siècles, sont tous caractérisés par la présence d’un système d’enceinte délimité par des fossés et des palissades.

Une des particularités du Chasséen de la vallée de la Garonne est l’utilisation massive de fosses à galets chauffés. Ces aménagements, de forme circulaire ou allongée, peuvent atteindre plus d’une dizaine de mètres de long. Ils s’apparentent aux actuels fours polynésiens dont le principe est la cuisson indirecte des aliments. Les trois grands sites chasséens de la région toulousaine en ont livré à eux seuls plus d’un millier, ce qui constitue un unicum pour le Néolithique en France. La multitude de ces aménagements sur un même lieu, souvent disposés en véritables batteries, pourrait témoigner d’un usage collectif à l’occasion de cérémonies ou de rassemblements de plusieurs communautés.

La quasi-totalité des vingt-cinq sépultures chasséennes découvertes dans le Toulousain proviennent d’aménagements dont la fonction initiale n’était pas funéraire, des fossés pour l’essentiel. Mais en 2008, pour la première fois, de véritables tombes totalement dissociées des zones d’habitat ont été découvertes sur la ZAC Andromède à Sauzas (Blagnac). Cette petite aire sépulcrale, unique et remarquable à plus d’un titre, regroupe six sépultures en fosse recouvertes d’un tertre en galets.

Vers 3500 ans avant notre ère, une dégradation du climat semble être à l’origine de l’abandon de certains terroirs, alors moins fertiles, et d’une baisse démographique. Les grands sites ceinturés chasséens sont délaissés au profit de petits habitats ouverts, plus dispersés et de courte durée, signe probable d’une mobilité accrue des populations. Une fouille préventive réalisée sur la ZAC Andromède à Blagnac a mis en évidence, sur plus de cinq hectares, un palimpseste d’occupations successives correspondant sans doute à des fréquentations saisonnières. Toujours à Blagnac, on peut citer les sites de Cassagna 1 et Cassagna 2 qui ont tous deux livré des vestiges de cette période. À Castelnau-d’Estrétefond, les fouilles dirigées sur la ZAC Eurocentre ont également révélé une occupation originale en milieu humide à Fontréal.